Las tecnologías de secuenciación de próxima generación son cada vez más utilizado en una variedad de campos desde la investigación biológica básica hasta de la farmacogenómica a la medicina clínica. La preparación de la biblioteca es el primer paso crucial de un flujo de trabajo típico de NGS e implica varios pasos de limpieza de ADN. Para aprovechar al máximo el potencial de Tecnologías NGS, se necesitan avances rápidos en términos de procesamiento de rendimiento y tiempo de respuesta.
Para cumplir con esto necesidad, Omega Bio-tek ha desarrollado un protocolo totalmente automatizado empleando perlas Mag-Bind TotalPure NGS (M1378) en un Tecan Estación de trabajo Fluent 780 para realizar los pasos de limpieza necesarios durante la preparación de la biblioteca. Esta nota de aplicación demuestra la capacidad de las perlas Mag-Bind TotalPure NGS para unir diferentes longitudes de fragmentos alterando la relación de volumen de perlas magnéticas utilizadas para el volumen de entrada de ADN. El rendimiento de esta solución de alto rendimiento en diferentes proporciones de perlas a muestra se evaluó en función de la recuperación de ADN y calidad. Nuestros resultados indican que este flujo de trabajo automatizado puede limpiar de manera eficiente noventa y seis muestras con una entrada de muestra de ADN> 100 pb y hasta 100 µL de volumen en menos de 35 minutos.
Materiales y Métodos
Un volumen de 25 µL de una escalera de 50 pb se diluyó 20 veces y limpiado con cuentas Mag-Bind TotalPure NGS en relaciones de volumen de muestra de 0.6X, 0.8X, 1.0X y 1.2X. Cuatro 25 µL se transfirieron alícuotas de la escalera de 50 pb (dilución 1:20) a una placa de 96 pocillos por cuadruplicado y se trasladó al Tecan Estación de trabajo fluida para limpieza de ADN en las cuatro proporciones diferentes mencionado anteriormente. El instrumento Tecan fue programado para realizar diversas tareas de manipulación de líquidos y basadas en perlas magnéticas según lo exigido por el protocolo de perlas Mag-Bind TotalPure NGS. A Tecan Fluent 780 se configuró para adaptarse a la automatización del protocolo Mag-Bind TotalPure NGS, incluido el dispensación de perlas según la proporción de limpieza, unión, lavado y finalmente elución del ADN en 30 µL de Tris-HCl 10 mM (pH 8,5).
El flujo de trabajo de limpieza se automatizó completamente a partir de la alícuota de la muestra en la placa de 96 pocillos hasta el producto eluido final. Se incluyó una alícuota de escalera de 50 pb sin procesar (dilución 1:20) como un control para el análisis posterior a la limpieza y para arrojar luz sobre el tamaño de fragmentos recuperados en los cuatro diferentes granos a muestra proporciones probadas.
TapeStation® 2200 y en comparación con la escalera de 50 pb sin procesar (control de dilución 1:20) utilizando un ScreenTape® D1000 de alta sensibilidad. Se utilizó el software de análisis TapeStation 2200 para estimar el porcentaje de ADN recuperado, así como los tamaños de los fragmentos eliminados después de la limpieza en cuatro proporciones diferentes. Los resultados también se compararon con un informe interno de terceros no afiliados1 publicado por Genomics & Cell Characterization Core Facility de la Universidad de Oregon para validar la metodología y la configuración de limpieza de automatización.
Resultados y discusión
Análisis TapeStation del ADN después de la limpieza en varias proporciones de perlas Mag-Bind TotalPure NGS al volumen de muestra es como como se muestra en la Figura 1. Los resultados muestran que al alterar la proporción de perlas a muestra, es posible unir selectivamente fragmentos de ADN. El porcentaje promedio de ADN eliminado a 0.6X, 0.8X, 1.0X y 1.2X perlas: proporciones de muestra (v / v) se calcularon en base a la control (escalera de 50 pb sin procesar) en diferentes tamaños de fragmentos (Figura 2). Los cálculos se basaron en las concentraciones de los diferentes fragmentos de ADN de la escalera de 50 pb según lo estimado por el software de análisis TapeStation 2200. Los 50 pb y 100 fragmentos de pb de la escalera de 50 pb se omitieron por completo en todas las diferentes proporciones probadas. Los resultados demuestran una mayor volúmenes de perlas son capaces de unir fragmentos de menor tamaño en comparación con volúmenes de perlas más bajos. Por ejemplo, una proporción de 1.2X de perlas para muestrear fragmentos recuperados de más de 150 pb, mientras que solo se recuperaron tamaños de fragmentos de 300 pb y superiores cuando se utilizó una relación de 0.8X. La Tabla 1 muestra que el porcentaje promedio de ADN eliminado siguiendo el protocolo automatizado en Tecan Fluent 780 está de acuerdo con los resultados publicados en [1]. Los resultados no solo coinciden pero muestran tendencias similares en términos de unión al ADN capacidad a diferentes volúmenes de perlas a muestras. Estos resultados validar la configuración del instrumento y el protocolo de limpieza automatizado.
Conclusiones
Cuenta Mag-Bind TotalPure NGS (M1378) de Omega Bio-tek el protocolo integrado en la estación de trabajo Tecan Fluent ofrece una solución de limpieza de ADN automatizada de alto rendimiento para PCR y Aplicaciones NGS. Con este flujo de trabajo, hasta noventa y seis muestras se pueden procesar hasta 100 µL de volumen en menos de 35 minutos.
La configuración de plataforma propuesta con este flujo de trabajo puede adaptarse a diferentes configuraciones de Fluent según el líquido disponibilidad y tamaño del brazo de manipulación. Las limpiezas de ADN en diferentes Las proporciones de perlas a muestra se llevaron a cabo en la misma placa dilucidar la facilidad y flexibilidad del flujo de trabajo automatizado. El flujo de trabajo propuesto con las perlas magnéticas no es solo fácil de usar, pero también elimina la necesidad de consumir mucho tiempo limpiezas basadas en electroforesis. La gran promesa y la capacidad de ajuste de un sistema automatizado de limpieza de microesferas para seleccionar los tamaños de fragmentos de ADN deseados ofrece un potencial significativo en Aplicaciones NGS.
